روش کروماتوگرافی مایع با عملکرد بالا (HPLC)

آنالیز HPLC

آنالیز HPLC یا کروماتوگرافی مایع با عملکرد بالا (High Efficiency Liquid Chromatography)، مناسب برای آنالیز و جداسازی ترکیبات شیمیایی و گیاهی بوده و در زمینه های مختلف شیمی، داروسازی، شیمی صنعتی و تشخیص های کلینیکی کاربرد دارد. آنالیز HPLC یا کروماتوگرافی مایع با عملکرد بالا سریعترین رشد را در بین تمام فنون جداسازی تجزیه ای با فروش سالیانه در گستره میلیارد دلار داشته است. آنالیز کیفی، برای تشخیص و شناسایی نوع ترکیبات انجام میشود.

توضیحات بیشتر در اینجا :آنالیز HPLC یا کروماتوگرافی مایع با کارایی بالا (که گاهی به آن کروماتوگرافی مایع با فشار بالا گفته می شود)، آنالیز HPLC­، یک روش کروماتوگرافی است که می تواند مخلوطی از ترکیبات را از هم جدا کند و در بیوشیمی و شیمی تحلیلی برای شناسایی کمیت و خالص سازی اجزای مخلوط استفاده می شود. آنالیز HPLC به طور معمول از انواع مختلفی از مراحل ثابت استفاده می کند، پمپی که فاز (های) متحرک و آنالیت را از طریق ستون و یک آشکارساز حرکت می دهد تا زمان احتمالی حفظ آنالیت را فراهم کند. دتکتور همچنین ممکن است اطلاعات اضافی مربوط به آنالیت، (یعنی داده های طیف سنجی UV­/­Vis را برای آنالیت در صورت مجهز بودن) فراهم کند. مدت زمان نگهداری آنالیت بسته به استحکام فعل و انفعال آن با فاز ثابت، نسبت­/­ترکیب حلال (های) مورد استفاده و سرعت جریان فاز متحرک متغیر است. این نوعی کروماتوگرافی مایع است که از اندازه ستون کوچکتر، واسطه کوچکتر در داخل ستون و فشار بالاتر فاز متحرک استفاده می کند .

با آنالیز HPLC:

تجهیزات پزشکی :پمپ فشار بیشتری را برای جابجایی فاز متحرک و آنالیت از طریق ستون متراکم فراهم می کند. افزایش تراکم از اندازه ذرات کوچکتر ناشی می شود. این امر باعث می شود در مقایسه با کروماتوگرافی ستونی معمولی، جدایی بهتری در ستون هایی با طول کمتر وجود داشته باشد. نمونه ای که باید مورد آنالیز  قرار گیرد یا از هم جدا شود در حجم کم، به جریان فاز متحرک وارد می شود. محلول منتقل شده از طریق ستون با اثر متقابل شیمیایی یا فیزیکی خاص با فاز ثابت موجود در ستون کاهش می یابد. سرعت محلول بستگی به ماهیت نمونه و ترکیبات مرحله ثابت (ستون) دارد.

زمانیکه نمونه از انتهاي ستون خارج مي شود زمان نگهداري ناميده مي شود. زمان نگهداري در شرايط خاص ويژگي شناسايي يك نمونه معين در نظر گرفته مي شود. استفاده از ستونی با اندازه ذرات کوچکتر (که باعث فشار کمتری می شود) سرعت خطی را افزایش می دهد و باعث می شود زمان کمتری برای انتشار در داخل ستون و بهبود وضوح کروماتوگرام باشد. حلالهای رایج استفاده شده شامل ترکیب حل شدنی از آب یا مایعات ارگانیک مختلف (رایج ترین آنها متانول و استونیتریل) است. آب ممکن است حاوی بافر یا نمکی برای جداسازی اجزای نمونه باشد یا ترکیباتی مانند اسید تری فلوئوراستریک که به عنوان ماده جفت کننده یون عمل می کند.

کاربردهای آنالیز

• آنالیز مواد غذایی و طعم دهنده ها

غربالگری سریع و آنالیز اجزای موجود در نوشیدنی های غیر الکلی

آنالیز چند هسته ای 301 سموم دفع آفات در نمونه های مواد غذایی توسط کروماتوگراف طیف سنجی جرمی

برای داروها و محصولات مراقبت شخصی در آب، خاک، رسوبات و زیست بومها توسط HPLC / MS / MS

جداسازی سریع و شناسایی ترکیبات کربونیل توسط HPLC

آنالیز ترکیبات آنتی اکسیدان فنلی و اروکامید در پلیمر با استفاده از سرعت سریع LC

یک محلول کامل برای آنالیز ملامین واسید سیانوریک در غذای حیوانات اهلی توسط GC­/­MS و آبی فاز طبیعی LC / MS / MS

تعیین بنزودیازپین ها در مایعات خوراکی با استفاده از LC / MS / MS

• آنالیز پروفایل ناخالصی دارویی

پروفایل ناخالصی با سیستم LC

شمای کلی از کروماتوگرافی مایع

اجزای یک مخلوط، بر اساس تمایل هر جزء به فایل مایع، در ستون، جداسازی می‌شوند. بنابراین، اگر اجزا، قطبیت متفاوتی داشته باشند و فاز ساکنی با قطبیت شدید از میان ستون عبور کند، یکی از اجزا نسبت به بقیه، با سرعت بیشتری از داخل ستون عبور خواهد کرد. از آن‌جایی که یک ترکیب، به صورت گروهی حرکت می‌کنند، ترکیبات به صورت باندهایی جداگانه و مشخص در ستون از یکدیگر متمایز هستند. اگر اجزای جدا شونده، رنگی باشند، در زمان کروماتوگرافی، باندهای رنگی متناظر با هر گروه قابل تشخیص خواهند بود. در غیر اینصورت، همچون «کروماتوگرافی مایع با عملکرد بالا» (High Performance Liquid Chromatography)، حضور باندهای متناظر هر گروه را به کمک سایر روش‌ها همچون ماورابنفش-مرئی شناسایی می‌کنند.

نحوه جدایش اجزا در کروماتوگرافی مایع

در یک مخلوط دو جزئی با عبور فاز ساکن از میان ستون،‌ هر دو جزء به صورت باندهایی مجزا از یکدیگر جدا می‌شوند. زمانی که هر جزء از ستون، شویش شود، هر کدام را می‌توان بسته به نوع روش مورد نظر،‌ جداسازی و بررسی کرد. بر اساس نوع قطبیت فازهای ساکن و متحرک،‌ قطبیت‌های نسبی هر دو جزء قابل تعیین است.

آماده‌سازی ستون کروماتوگرافی مایع

در این بخش، توضیحات کوتاهی در خصوص آماده‌سازی ستون در یک کروماتوگرافی مایع داده می‌شود و در ادامه متن، به طور دقیق‌تر، کروماتوگرافی HPLC مورد بررسی قرار می‌گیرد. فاز ساکن در «کروماتوگرافی ستونی» (Column Chromatography)، به طور معمول، یک جاذب جامد است. این جامد می‌تواند اجزای مایع و گازی را در سطح خارجی خود حفظ کند. ستونی که به طور معمول در کروماتوگرافی ستونی از آن بهره می‌گیرند همانند است که در کروماتوگرافی ستونی با مقیاس پایین مورد استفاده قرار می‌گیرد. بخش نازک خروجی را با پشم شیشه یا صفحه‌ای متخلخل پر می کنند تا مواد پرشده داخل ستون را حفظ کند. در ادامه، جامد جاذب (به طور معمول سیلیکا) را به صورت فشرده به داخل لوله شیشه‌ای می‌فرستند تا ستون را تکمیل کند. پر کردن ستون با فاز ساکن باید با دقت کافی انجام شود تا توزیع یکنواختی از مواد در داخل ستون صورت بگیرد.

این توزیع یکنواخت برای جلوگیری از ایجاد حباب یا کانالی‌شدن در ستون انجام می‌شود. در انتهای آماده‌سازی ستون، حلال مورد استفاده در فاز متحرک را از میان ستون خشک عبور می‌دهند. چنین ستونی را «تَرشده» (Wetted) می‌نامند. زمانی که ستون، به خوبی آماده شد، نمونه را در بالای ستون قرار می‌دهند.

اساس کروماتوگرافی HPLC

اجزای مولکولی در کروماتوگرافی HPLC،‌ دو دسته مهم را به نام آنالیت و ماتریکس تشکیل می‌دهند. آنالیت، اجزای مولکولی مورد نظر و ماتریکس، سایر اجزای نمونه هستند. بمنظور انجام کروماتوگرافی HPLC نمونه را به یک فاز متحرک وارد می‌کنند تا از میان فاز ساکن عبور کند. فاز متحرک را با شاخصه‌های مختلفی همچون ترکیب اجزا، ، خواص فرابنفش، و امتزاج‌پذیری با سایر حلال‌ها توصیف می‌کنند.

فاز ساکن می‌تواند توده‌ای از مایع متراکم، لایه‌ای مایع بر سطحی جامد یا یک لایه «بین سطحی» (InterFacial) بین مایع و جامد باشد. در کروماتوگرافی HPLC فاز ساکن به طور معمول به صورت یک ستون پرشده با اجزای کوچک متخلخل است که فاز متحرک مایع، به کمک یک پمپ از میان آن عبور می‌کند. در حقیقت، توسعه کروماتوگرافی HPLC با توسعه ستون‌های جدید همراه بود که این امر نیازمند اجزای جدید، فازهای ساکن جدید و دستورالعمل‌های بهبودیافته برای پرکردن ستون است. تصویری از یک دستگاه کروماتوگرافی HPLC در زیر نشان داده شده است.

شرح دستگاه کروماتوگرافی HPLC

اجزای اصلی یک دستگاه کروماتوگرافی HPLC در زیر نشان داده شده است. نقش پمپ در این دستگاه، حرکت دادن فاز متحرک با یک نرخ جریانی مشخص بر حسب بر دقیقه است. وظیفه «انژکتور» (Injector)، تزریق نمونه مایع به جریان فاز متحرک است. ستون دستگاه، مهم‌ترین بخش دستگاه کروماتوگرافی با عملکرد بالا را تشکیل می‌دهد. فاز ساکن در ستون نیز اجزای نمونه مورد نظر را از یکدیگر جدا می‌کند. از آشکارساز بمنظور شناسایی مولکول‌های شویش شده از ستون بهره می‌گیرند. همچنین، از یک کامپیوتر برای تحلیل و ارزیابی داده‌ها استفاده می‌کنند. در حقیقت، از کامپیوتر نه‌ تنها برای کنترل پارامترهای دستگاه بلکه برای ارزیابی «زمان بازداری» (Retention Time)، اجزای نمونه و آنالیز مقداری بهره می‌گیرند.

ستون کروماتوگرافی

بر اساس خواص فاز ساکن در ستون، از مکانیسم‌های جدایش مختلفی در کروماتوگرافی استفاده می‌شود که از آن جمله می‌توان به «کروماتوگرافی فاز نرمال» (Normal Phase Chromatography)، «کروماتوگرافی فاز معکوس» (Reverse Phase Chromatography)، «کروماتوگرافی تبادل یونی» (Ion Exchange Chromatography)، «کروماتوگرافی اندازه طردی» (Size Exclusion Chromatography) و «کروماتوگرافی میل ترکیبی» (Affinity Chromatography) اشاره کرد.

کروماتوگرافی فاز نرمال

در این روش، ستون را با ذرات قطبی معدنی پر و از یک فاز متحرک ناقطبی برای عبور از میان فاز قطبی استفاده می‌کنند. از کروماتوگرافی فاز نرمال به طور عمده برای خالص‌سازی نمونه‌های خام، جداسازی نمونه‌های به شدت قطبی یا جداسازی تحلیلی با کروماتوگرافی بهره می‌گیرند. یکی از مشکلات استفاده از این روش این است که آب، حلالی قوی برای کروماتوگرافی فاز نرمال به شمار می‌آید و وجود آب در فاز متحرک به طور محسوسی بر بازداری نمونه تاثیر گذار است. در جدول زیر، نوع فازهای متحرک و ساکن در کروماتوگرافی فاز نرمال و معکوس آورده شده است.

	فاز ساکن	فاز متحرک
فاز نرمال	قطبی	ناقطبی
فاز معکوس	ناقطبی	قطبی

کروماتوگرافی فاز معکوس

در کروماتوگرافی فاز معکوس، فاز ساکن، دارای خاصیت «آب‌گریز» (Hydrophobic) است درحالیکه فاز متحرک خاصیتی قطبی دارد. همانطور که در جدول بالا نیز نشان داده شده، نوع قطبیت فازها، عکس کروماتوگرافی فاز نرمال است. نوع برهم‌کنش‌ها در کروماتوگرافی HPLC با فاز معکوس (RP-HPLC) را به صورت نیروهای آب‌گریز در نظر می‌گیرند. این نیروها نتیجه انرژی حاصل از تغییر در ساختار‌های دوقطبی حلال است. جدایش مواد به طور عمده ناشی از تقسیم شدن آنالیت بین فاز ساکن و متحرک ذکر می‌شود.

مولکول‌های حل‌شونده در تعادل بین فاز ساکن آب‌گریز و فاز متحرک با قطبیت جزئی هستند. هر قدر مولکول آب‌گریز (ناقطبی) باشد، زمان بازداری طولانی‌تری خواهد داشت درحالیکه ترکیبات معدنی یونیزه شده، یون‌های معدنی و مولکول‌های فلزی قطبی،‌ زمان بازداری کمی دارند.

کروماتوگرافی تبادل یونی

مکانیسم تبادل یونی، بر اساس برهم‌کنش الکترواستاتیک بین یون‌های آبدار از نمونه و با بار مخالف فاز ساکن بنا شده است. دو مکانیسم برای جداسازی مورد استفاده قرار می‌گیرد. در یک مکانیسم، به هنگام شویش، از فاز متحرک با یون‌هایی استفاده می شود که با یون‌های آنالیت جایگزین شوند و این را به خارج از ستون هدایت می‌کنند.

مکانیسم دیگر، شامل اضافه کردن به فاز ساکن برای تغییر اجزای نمونه از حالت اولیه خود است. با انجام چنین فرآیندی بر روی مولکول‌ها، عمل شویش انجام می‌شود. علاوه بر تبادل یون‌ها، تبادل یونی فاز ساکن می‌تواند برخی از مولکول‌ها را به صورت خنثی نگه‌دارد. این فرآیند با میزن بازداری در تشکیل کمپلکس‌ها مرتبط می‌شود. یون‌های ویژه‌ای همچون می‌توانند بر رزین‌های تبادل کاتیونی قرار بگیرند و با پذیرفتن جفت‌الکترون‌های ناپیوندی، لیگاندهای «دهنده» (Donor) را بپذیرند.

کروماتوگرافی‌های تبادل یونی امروزی، امکان تحلیل‌های مقداری در حل‌شونده را دارند. از آن‌ها می‌توان بمنظور آنالیز نمونه‌های محلول در آب آنیون‌های معدنی استفاده کرد. کاتیون‌های فلزی و آنیون‌های معدنی به طور عمده توسط برهم‌کنش‌های یونی با رزین‌های تبادل یونی، از یکدیگر جدا می‌شوند.

یکی از کاربردهای صنعتی کروماتوگرافی تبادل یونی، در صنایع غذایی است که برای تعیین اجزای شامل ، ، و از آن‌ بهره می‌گیرند. همچنین، این روش می‌تواند برای تعیین یون‌های معدنی و آلی در آب‌ها استفاده شود